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Biocoat-內皮細胞成管實驗步驟
來源: | 作者:pmo60c4f9 | 發布時間: 2021-05-24 | 17878 次瀏覽 | 分享到:

康寧生命科學（吳江）有限公司
江蘇省吳江市經濟開發區
龐金路 1801號 T03/17
www.corning.com/lifesciences/china







實驗方法
實驗程序：內皮細胞管形成實驗



血管再生描述了許多細胞事件，包括內皮細胞遷移、侵襲和分化成毛細血管。通過血管再生劑，體外的血管再生實驗已經作為一個模型來研究內皮細胞的分化和內皮細胞管形成的調控。通過使用自動成像儀和MetaMorph ? 軟件能實現熒光標記細胞的圖像采集和定量。在下列的實驗程序中，當最小化鈣熒光素乙酰氧基甲酯對人微血管內皮細胞系(HMEC-1和HMVEC)和初級人臍靜脈內皮細胞(康寧HUVEC-2)的毒性效應時，內皮細胞管形成的實驗條件和用于定量的細胞標記已經優化以最大化熒光信號。實驗結果可能的變異取決于細胞、使用的染料和特定的實驗條件。

材料：

  • Corning ? Matrigel ? 基質，10 mL (康寧貨號354234)；康寧基底膜基質批次推薦濃度：10 mg/mL或更高。

  • Falcon ? 24孔平底標準組織培養處理板(康寧貨號353047)。

  • 內皮細胞培養基(例如，EGM-2 MV，Lonza貨號CC-4147)。

  • 作為血管生成刺激物的小牛血清或合適的生長因子。

  • Hanks平衡鹽溶液(HBSS) (例如，Life Technology貨號14025-092)。

  • 熒光基團(例如，康寧鈣熒光素乙酰氧基甲酯熒光染料，10x50 μg，康寧貨號No.354216)。

  • 二甲基亞砜。

  • 濕潤的組織培養抑制劑37°C，5% CO 2 濃度。

  • 內皮細胞，例如HMEC-1、HMVEC或康寧HUVEC-2細胞(康寧貨號354151)。

  • 超凈工作臺

  • 自動成像儀、熒光顯微鏡、細胞管定量軟件。


實驗程序：

顏色的變化可能發生在冷凍或解凍康寧人工基底膜基質藥瓶的過程中，由于二氧化碳與重碳酸鹽緩沖液和酚紅的相互作用，顏色會從淡黃色變化到深紅色。顏色的變化是正常的，不影響產品功效，在與5%的二氧化碳平衡后顏色將消失。
1.1 在冰上4°C解凍康寧基底膜基質。
1.2 一旦解凍，旋轉藥瓶以確保材料均勻分散。
1.3 向藥瓶的頂端噴灑70%乙醇，并在空氣中干燥。
1.4 將產品放置在冰上，處理時請使用無菌操作。
1.5 利用預冷的移液管、吸頭和管分裝材料，并立即冷凍。避免反復凍融。

預防措施
康寧基底膜基質在22°C到35°C將快速凝膠化。請在冰上4°C過夜解凍。在使用前請將產品放置在冰上，當準備使用康寧基底膜基質是，請預冷移液管、吸頭和管。

2.0 包被程序
注意：一旦凝膠化， Corning ? Matrigel ? 基質應該被立即使用。我們推薦至少 10 mg/mL 濃度的蛋白和康寧基底膜基質一起使用?？祵幓啄せ|的濃度是批次特異的，并且 以分析證明書為基礎。您可以預先檢查基質的批次，通過聯系康寧來預定適合您蛋白濃度的特定批次的康寧基底膜基質。
2.1 按推薦的方法解凍康寧基底膜基質。使用預冷的移液管，均勻的混合。
2.2 將24孔細胞培養板放置在冰上，向每個孔中加入0.289 mL冷凍的康寧基底膜基質(10mg/mL)。該量對于覆蓋整個生長表面應該是足夠的。如果康寧基底膜基質需要稀釋到10 mg/mL，請使用無血清培養基稀釋。
2.3  在移液管吸取液體加入到每個孔中時，請避免氣泡。如果孔中含有氣泡，請在4°C預冷的離心機中將培養板離心300 x g，10分鐘。
2.4 在37°C培養30-60分鐘。
2.5 培養板現在可以使用了。

3.0 內皮細胞管形成實驗
3.1 準備上述的內皮細胞管形成培養板。
3.2 用要求的內皮細胞培養基培養內皮細胞，達到要求的細胞融合度。對于康寧HUVEC-2、HMVEC和HMEC-1，推薦達到70-80%的細胞融合度。
注意 ：原代細胞應該低傳代 ( 例如， HUVECs 細胞不應該傳代超過 5 次 ) 。
3.3 當使用康寧HUVEC-2、HMVEC或HMEC-1細胞時，通過胰蛋白酶處理單層細胞來制備細胞懸液，并且在4x10 5 個細胞/mL時用含5-10%血清或您需要的血管再生促進劑的培養基重懸細胞。在此步驟時也可以外加測試劑，例如抑制劑。
注意 ：大部分內皮細胞培養基沒有足夠濃度的血清來失活胰蛋白酶。推薦使用胰蛋白酶中和溶液。
3.4 向每個孔中加入300 μl的細胞懸液(1.2x10 5 個細胞的康寧HUVEC-2、HMVEC或HMEC-1)。
3.5 在37°C、5% CO2濃度的條件下將血管再生實驗培養板培養16-18小時。
4.0 細胞管形成的測定——Corning ? 鈣熒光素乙酰氧基甲酯熒光染料的標記
注意： 24 孔培養板的每個孔需要 300 μl 溶于 Hanks 平衡鹽溶液 (HBSS) 的 8 μg/mL 的鈣熒光素乙酰氧基甲酯染料。由于移液時的損失，我們推薦每板配制 9 mL 的染料溶液。如果您使用的是 50 μg 的瓶裝康寧鈣熒光素乙酰氧基甲酯，那么您需要 2 瓶。推薦使用 HBSS 是因為培養基的使用會導致標記的自溶，產生不能接受的高背景。這一部分可以在非無菌的條件下操作。
4.1 準備8 μg/mL的康寧鈣熒光素乙酰氧基甲酯溶液。對于每個培養板，您需要9.0 mL的康寧鈣熒光素乙酰氧基甲酯染料溶液。如果您使用2瓶50 μg的熒光素乙酰氧基甲酯，請量取12.5 mL的HBSS并加熱到37°C。在每瓶50 μg的康寧鈣熒光素乙酰氧基甲酯中加入20 μl的DMSO，之后將2瓶的量轉移至總體積為12.5 mL的HBSS中，使終濃度為8μg/mL。
4.2 在培養之后(步驟3.5)，小心地從培養板中移除培養基。請小心不要破壞可能已經在康寧基底膜基質中形成的細胞管。使用巴氏吸管輕柔的移除培養基可以完成這一步驟。
4.3 向每個孔中加入750 μl的HBSS，使用HBSS漂洗培養板。像4.2步驟描述的那樣去除HBSS。
4.4 重復漂洗一次。
4.5 向每孔中加入300 μl 8 μg/mL的溶于HBSS的康寧鈣熒光素乙酰氧基甲酯標記細胞，在37°C、5% CO 2 濃度的條件下培養30-40分鐘。
4.6 像4.2步驟描述的那樣去除HBSS。
4.7 像4.3步驟描述的那樣用HBSS漂洗培養板2次。
4.8 現在培養板可以利用自動成像儀或熒光顯微鏡拍照。
注意 ：一旦發生水解，細胞中康寧鈣熒光素乙酰氧基甲酯的泄露會導致較高的背景。標記好的培養板需要在 4°C 存放 1-2 小時以最小化背景的增加。
4.9 使用要求的硬件和軟件獲取圖片。我們使用Gen-1基于細胞的篩選系統和MetaMorph ?軟件來自動獲取圖片并測量細胞管長度。
4.10  如果沒有自動圖像采集設備，可以使用熒光顯微鏡來手動獲取圖像，處理圖像時請使用MetaMorph或其他相似的軟件。
注意 ：不同的研究人員會測量許多參數，例如細胞管長度、細胞管面積或分支點。在血管再生系統中，內皮細胞管形成 ( 康寧貨號 354149 和 354150) ，利用 MetaMorph 軟件系統來測量細胞管的形成。一些其他用于測量細胞管形成范圍的常用圖像采集軟件包包括 BDPathway ? 855 生物圖像采集器，其含有精細的圖像采集和數據分析算法； Image-Pro? Plus( 媒體控制 www.mediacy.com) 和 NIH 圖像采集 (http://rsb.info.nih.gov/nihimage/index.htmL) 。